qPCR（Quantitative real-time PCR）實驗中，模板質量、引物設計、qPCR反應體系、程序設置，均是影響實驗成功的重要因素。其中，qPCR的引物設計尤為重要，決定了qPCR擴增效率和擴增產物的特異性，引物設計都有哪些原則和要點，一起來了解一下吧！

qPCR引物設計原則

1. 引物長度一般在18~30 nt之間，擴增產物長度盡量控制在 80~200 bp之間。

引物設計太短會導致非特異擴增，太長則容易形成二級結構(如發夾結構)。擴增產物太長會影響到PCR擴增效率。

2. 引物GC含量控制在40%~60%之間，正反向引物Tm值介于55~65℃之間，正反引物的Tm差值不超過3℃。

3. 引物3′端盡量避免選擇A，最好選擇T。

引物3′端錯配時，不同堿基引發合成效率存在著很大的差異，當末位堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能引發鏈合成，而當末位為T時，錯配引發效率大大降低。

4. 單個堿基重復≤3個。

引物中四種堿基的分布最好是隨機的，尤其3′端避免超過3個連續的G或C，因為3個以上連續的G或C容易在GC富集序列區產生錯誤引發。

5. 引物設計區域應避開復雜二級結構。

擴增產物單鏈形成二級結構會影響PCR順利進行，可用軟件（比如RNAstructure）預測靶序列是否存在二級結構，盡量避開該區域設計引物。

6. 引物自身和引物之間應盡量避免堿基連續互補。

引物自身和引物之間不能有連續4個堿基的互補，引物自身存在互補序列會形成發夾結構而影響引物與模板的復性結合，而引物之間互補會產生引物二聚體而降低PCR效率甚至影響定量準確性。如果引物二聚體及發夾結構不可避免，應盡量使其△G值不要過高（應小于4.5kcal/mol）。

7. 引物擴增的是目標特異產物。

qPCR檢測最終目的是了解目的基因的豐度，如果出現非特異擴增，定量會不準確。所以設計好引物后需要在序列數據庫中比對產物的特異性。


 

qPCR引物設計方法

以上我們了解了qPCR引物設計原則，看上去內容多而復雜，在實際應用中，我們可借助生物學軟件完成qPCR引物設計。常用的軟件有Primer-BLAST、Primer3、Primer Premier、Primer Express、Beacon Designer、Oligo 7等，NCBI網站的Primer-BLAST無需下載軟件，可以直接打開網頁設計引物，除了常規引物參數設置外，還可以設置跨越內含子引物和檢測引物的特異性，應用非常廣泛。接下來我們通過以下三步來學習利用Primer-BLAST成功設計qPCR引物。

01 查找目的基因序列

qPCR方法可以檢測基因組DNA含量，也可以檢測基因轉錄水平的表達量（RNA的含量），后者需要先提取組織部位的RNA，進行反轉錄得到cDNA，再做檢測。所以設計引物之前需要明確實驗目的，明確模板是DNA還是cDNA，不同類型模板，需要下載的序列是不同的。基因表達量的檢測是目前qPCR的主要應用方向，因此今天以基因表達量分析為例介紹qPCR引物的設計方法。

以水稻產量基因GW2為例設計引物，在NCBI數據庫主頁Gene數據庫中搜索GW2，獲得該基因mRNA的Accession號和FASTA序列。

02 設計引物

打開NCBI的Primer-BLAST頁面，出現PCR Template，Primer Parameters，Exon/intron selection，Primer Pair Specificity Checking Parameters四種參數設置。

① PCR Template是針對模板的設置，設計人員可以選擇輸入accession號、FASTA序列或者上傳FASTA序列文件等方式導入模板序列，優先輸入accession號，這種方式在輸出頁面可以直觀地展現引物對應外顯子的位置。Range可以指出引物位置范圍，如果我們只想在CDS區設計引物，可以把范圍直接鎖定在CDS區，此處未填寫代表全長序列都參與設計。

② Primer Parameters是針對引物參數的設置，本次為新引物設計，無需填寫引物序列。PCR產物大小建議設置為80~200 bp，如果模板復雜較難設置出合適的引物，產物大小可適當延長至300 bp。輸出引物對數和引物熔解溫度（Tm值）選擇默認設置即可。

③ Exon/intron selection是針對基因組序列對mRNA序列擴增結果有影響而設計的跨內含子引物設計方案，參數包括引物是否跨越內含子或者exon-exon拼接點，設置參數越多，可能導致設計不出合適引物。所以這欄建議選擇默認設置，后續通過引物與外顯子的相對位置來篩選引物。

④ Primer Pair Specificity Checking Parameters是針對引物特異性篩選的參數設置，數據庫和物種根據實際情況選擇，這里選擇了Refseq mRNA和水稻。有些基因可能存在可變剪切而有多個轉錄本，Allow splice variants處打勾代表可以擴增所有轉錄本（此時PCR template處應輸入mRNA序列而非accession號）。其他參數選默認設置。

⑤ 點擊Get Primers，即自動生成合適引物。我們看到頁面中，Specificity of primers處描述“Primer pairs are specific to input template as no other targets were found in selected database: Refseq mRNA (Organism limited to Oryza sativa Japonica Group)"，代表10對引物均可特異性結合靶序列，我們可以選擇不同區域的兩對跨內含子的引物進行后續預實驗驗證。

03 引物預實驗驗證

軟件設計的引物在理論上是可用的，而實際實驗中，會有很多未知的因素而無法得到理想結果，所以強烈建議用預實驗驗證引物的有效性。

cDNA原液以4為倍數進行倍比稀釋，得到4~6個梯度，同時用預選的引物對進行qPCR擴增（要設置NTC）。結束后觀察熔解曲線的特異性和標準曲線的擴增效率，如果熔解曲線單一、尖銳，初步判斷產物是特異的，擴增效率要介于90%~110%之間，越接近100%，定量越準確。滿足這些條件后，建議把PCR產物（謹防污染）做一代測序驗證序列的特異性。最后，根據實驗需要選擇合適的qPCR引物用于后續正式實驗即可。

補充Tips：

1. 這里介紹了一般的qPCR引物設計流程，如果仍沒有篩選到合適的引物，需要針對性的調整參數，必要時需要在Advanced parameters調整參數以設計到合適的引物。

2. 在表達量研究實驗中，基因組殘留對后續定量結果的影響是必須考慮的因素，可以有兩種方式來解決此問題，其中一種方式在引物設計里介紹過，即設計跨越內含子的引物使基因組序列無法被擴增，另一種方式是在RNA提取過程中增加基因組去除的步驟，同時反轉錄實驗前也增加基因組去除的步驟以消除殘留DNA得到準確定量結果，后一種方式無需考慮引物設計的位置，引物設計更加簡化。

相信大家get到了利用Primer-BLAST設計qPCR引物的技術要點，引物設計非常重要，穩定可靠、特異、靈敏的熒光定量試劑也很重要。TIANGEN的熒光定量產品質量可靠、定量準確，一直以來受到廣大客戶的信賴。