BioDigital·青| 可以兼容qPCR體系的dPCR平臺

更新時間：2023-02-15 點擊次數：2282

新冠疫情爆發以來，熒光定量PCR（qPCR）的核酸檢測已經成為新冠確診的“金標準"。與免疫檢測相比熒光定量PCR具有較高的靈敏度，檢測窗口期較短，可以更早地確診是否病毒感染。qPCR是如何實現新冠定量的？首先，從咽拭子/鼻拭子中抽提獲得新冠的遺傳物質RNA，然后通過qPCR儀定量出拭子中的RNA病毒載量，就可以確定是否是新冠感染者。

熒光定量PCR技術最主要的參數是擴增曲線的ct值，該值與被定量樣本的濃度存在一定數學關系，在qPCR定量中樣本的濃度對數值（log值）與擴增曲線的ct值呈線性關系，ct值越小，濃度越高。根據采用的定量數學模型的差異，qPCR的定量分為外標定量（外標法）和內標定量（內標法）兩種。外標法是定量過程中需要使用一系列已知濃度的外標定量標準品（4-5個濃度梯度），與待檢測的樣本同時檢測，通過標準曲線算出待檢測的樣本，該方法用的較多。內標定量指已知濃度的標準品（即定量內標，1個濃度）,與待檢測的樣本在同一管內擴增檢測，需要保證內標與檢測樣本的擴增效率一致，才能準確計算出待檢樣本的濃度。

qPCR外標定量（標準曲線法）

需要做標準品的梯度稀釋，浪費5-10個反應孔做標準曲線，需同時擴增標準品和待檢測的樣本。

1）標準品和待檢樣本同時擴增，繪制標準曲線；

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圖1.外標定量標準曲線繪制

2）數據分析

需要繁瑣的數據整理，將待檢樣本的ct值代入標準品標準曲線計算出未知樣本的濃度。

無論是外標定量，還是內標定量，qPCR技術的定量均需要采用已知濃度的標準品來實現未知濃度樣本的定量。然而，在實際情況中標準品和待檢樣本的性質不會相同，很難保證待檢樣本和標準品的擴增效率達到一致。所以，qPCR定量的精準性會打折。盡管qPCR具有比免疫檢測技術更高的靈敏度，從新冠疫情的檢測過程中發現，qPCR技術需要做2-3次重復檢測，也會有一些無癥狀感染者轉陽的案例，都是因為qPCR技術的靈敏度相對較低導致的。

外標法

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內標法

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圖2.熒光定量PCR定量方法

數字PCR技術（dPCR）是一種核酸絕對定量技術，將反應體系均勻分配至2萬個獨立的反應微孔中，每個單元包含0個、1個、個別有多個目標核酸分子，在每個反應單元中分別對樣品進行擴增，擴增結束之后依據泊松分布原理對各個反應單元熒光信號進行分析，實現絕對定量。

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圖3.數字PCR熒光信號

紅黃藍綠各代表不同的檢測靶標，同一張芯片可以檢測多種靶點

相比傳統熒光定量PCR，數字PCR擁有高的檢測靈敏度（是熒光定量PCR的100倍以上，降低了“漏檢"風險）、特異性和精確性，并且無需標準品可實現定量，是真正的絕對定量技術。

數字PCR平臺定量

1）無需標準品，只需擴增檢測未知樣本即可。

2）數據分析可視化的圖片，無需數據統計，直接呈現待檢樣本的濃度（copies/μL）。

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qPCR和dPCR的差異主要在于是否需要分區檢測。qPCR不需要分區檢測，20μL反應體積中包含待檢測的靶標分子和反應試劑，該反應體系置于200μL的PCR反應管中擴增檢測信號；dPCR需要將20μL的反應體積（包含待檢分子和反應試劑）分到2萬多個體積只有1nL左右的微反應單元，實現數字化分割。數字PCR的分區擴增提高了PCR檢測靈敏度和精準性。

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表1.數字PCR與熒光PCR對比

那么，如何將qPCR體系轉移到dPCR平臺，實現PCR檢測結果的精準性和靈敏度？從檢測原理上看dPCR的分區擴增保證了PCR檢測的靈敏度和精準性，而qPCR可以通過加大待檢樣本的體積來提高檢測的靈敏度和特異性，但是這種方法提高的靈敏度和特異性是有限的。目前，qPCR已經有大量成熟的檢測試劑盒（包括科研、醫療等），而dPCR技術具有更高的檢測靈敏度和精準性，如果把目前qPCR檢測體系轉移到dPCR平臺就可以更快地實現PCR檢測的靈敏度和精準性。

實現該方法的轉移需要滿足3個條件：

1）qPCR試劑盒發光原理和dPCR檢測的原理一樣；

2）dPCR平臺開放，兼容第三方的試劑盒或者試劑；

3）適度的體系優化即可實現精準定量。

qPCR體系轉移到dPCR平臺會帶來2大優勢：

1）不需要標準品，既可實現絕對定量；

2）提高了qPCR試劑盒檢測的靈敏度和精準性。

BioDigital數字PCR“三明治"芯片，采用玻璃基底的微流控技術實現樣本的穩定分區，保證了每個液滴的獨立性和穩定性，具有更高的檢測靈敏度和準確性。另外，BioDigital數字PCR平臺具有很好的開放性，支持第三方qPCR試劑盒或試劑的轉移，通過一步簡單的體系優化甚至不需要優化的情況下，qPCR試劑盒就可以在BioDigital平臺上實現精準的定量。

#案例一

小海龜科技BioDigital數字PCR平臺兼容性測試——兼容客戶自由的試劑盒、平臺開放

測試內容：使用A客戶自有體系（包括檢測緩沖液、引物探針和模板）搭配小海龜數字PCR平臺進行測試；

測試目的：使用客戶成熟的熒光定量/數字PCR檢測體系，測試其與小海龜數字PCR平臺的兼容性，協助客戶將檢測體系遷移至我們的平臺，節省體系重新開發的成本；

測試結果：重復8次測試（包括陰性和陽性），平均有效液滴數19000+，表明客戶體系與小海龜數字PCR平臺可兼容，液滴生成未受影響；下圖為測試結果（原始圖和一維散點圖），結果表明數字PCR腔室分割正常，陽性液滴分布均勻，一維散點圖陰陽性界限明顯。

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